Factaran bacadh ann an ath-bheachdan PCR

Rè ath-bhualadh PCR, bidh cuid de nithean a chuireas bacadh air gu tric.
Air sgàth cho cugallach ‘s a tha PCR, thathas den bheachd gur e truailleadh aon de na factaran as cudromaiche a bheir buaidh air toraidhean PCR agus faodaidh e toraidhean meallta-dheimhinneach a thoirt gu buil.
Tha na diofar thùsan a dh’ adhbhraicheas toraidhean àicheil meallta a cheart cho cudromach. Ma thèid casg no bacadh a chur air aon no barrachd phàirtean riatanach den mheasgachadh PCR no an ath-bhualadh iomadachaidh fhèin, faodar bacadh a chur air an deuchainn breithneachaidh. Faodaidh seo leantainn gu èifeachdas nas lugha agus eadhon toraidhean àicheil meallta.
A bharrachd air casg, faodaidh call ionracas searbhag niuclasach targaid tachairt air sgàth suidheachaidhean luingeis agus/no stòraidh mus tèid an sampall ullachadh. Gu sònraichte, faodaidh teòthachd àrd no stòradh neo-iomchaidh leantainn gu milleadh air ceallan agus searbhagan niuclasach. Tha daingneachadh cheallan is clò agus leabachadh paraffin nan adhbharan aithnichte airson briseadh DNA agus tha e na dhuilgheadas leantainneach (faic Figearan 1 agus 2). Anns na cùisean sin, cha chuidich eadhon aonaranachd agus glanadh as fheàrr.

Figear 1 | Buaidh neo-ghluasadachd air ionracas DNA
Sheall electrophoresis gel agarose gu robh càileachd an DNA a chaidh a sgaradh bho earrannan paraffin de dh’obraichean-lannsa gu math eadar-dhealaichte. Bha DNA de dhiofar fhaid chuibheasach earrannan an làthair anns na h-earrannan a rèir an dòigh daingneachaidh. Cha deach DNA a ghleidheadh ​​ach nuair a chaidh a dhaingneachadh ann an sampallan reòta dùthchasach agus ann am formalin neodrach bufaireach. Mar thoradh air cleachdadh daingneachaidh Bouin làidir searbhagach no formalin gun bufaireach anns a bheil searbhag formach, chaidh call mòr DNA a thoirt gu buil. Tha an còrr den DNA gu math bloighte.
Air an taobh chlì, tha fad nam pìosan air a chur an cèill ann am paidhrichean kilobase (kbp)

Figear 2 | Call ionracas thargaidean searbhag niùclasach
(a) Ma bhios beàrn 3′-5′ air an dà shreath, bidh briseadh ann an DNA an targaid. Bidh co-chur DNA fhathast a’ tachairt air a’ phìos bheag. Ach, mura h-eil làrach annealing primer air a’ phìos DNA, chan eil ach iomadachadh loidhneach a’ tachairt. Anns a’ chùis as fheàrr, faodaidh na pìosan a chèile ath-shàthachadh, ach bidh na toraidhean beag agus fo ìrean lorg.
(b) Bidh call bhunait, gu h-àraidh air sgàth dì-phurachadh agus cruthachadh dimer thymidine, ag adhbhrachadh lùghdachadh ann an àireamh nan ceanglaichean-H agus lùghdachadh ann an Tm. Rè na h-ìre blàthachaidh sìnte, leaghaidh na prìmearan air falbh bhon DNA maitrís agus cha bhith iad a’ teannachadh eadhon fo chumhachan nach eil cho teann.
(c) Bidh bunaitean thymine faisg air làimh a’ cruthachadh dimer TT.
Is e duilgheadas cumanta eile a tha tric a’ tachairt ann an breithneachadh moileciuil an sgaoileadh nach eil cho math de dh’aigéid niùclasach targaid an taca ri às-tharraing phenol-cloroform. Ann an cùisean fìor dhona, faodaidh seo a bhith co-cheangailte ri toraidhean àicheil meallta. Faodar mòran ùine a shàbhaladh le lysis goileach no cnàmhadh einsímeach sprùilleach cealla, ach bidh an dòigh seo gu tric a’ leantainn gu cugallachd PCR ìosal air sgàth sgaoileadh gu leòr de dh’aigéid niùclasach.

Bacadh air gnìomhachd polymerase rè iomadachadh

San fharsaingeachd, thathar a’ cleachdadh casg mar bhun-bheachd soitheach gus cunntas a thoirt air na factaran uile a tha a’ leantainn gu toraidhean PCR neo-iomchaidh. Ann an seagh bith-cheimiceach teann, tha casg air a chuingealachadh ri gnìomhachd an einnsein, i.e., bidh e a’ lughdachadh no a’ cur casg air tionndadh fo-strat-toraidh tro eadar-obrachadh le làrach ghnìomhach an DNA polymerase no a cho-fhactar (me, Mg2+ airson Taq DNA polymerase).
Faodaidh co-phàirtean anns an sampall no diofar bhufairean is earrannan anns a bheil ath-bheachdan casg dìreach a chur air an enzyme no na co-fhactaran aige (me EDTA) a ghlacadh, agus mar sin a’ cur dheth am polymerase agus an uair sin a’ leantainn gu toraidhean PCR nas ìsle no àicheil meallta.
Ach, tha mòran eadar-obrachaidhean eadar co-phàirtean ath-bhualaidh agus searbhagan niùclasach anns a bheil targaid air an ainmeachadh mar ‘luchd-bacadh PCR’ cuideachd. Cho luath ‘s a thèid ionracas na cealla a bhriseadh le bhith gan dealachadh agus an searbhag niùclasach air a leigeil ma sgaoil, faodaidh eadar-obrachaidhean tachairt eadar an sampall agus an fhuasgladh mun cuairt air agus an ìre chruaidh. Mar eisimpleir, faodaidh ‘luchd-sgaoilidh’ DNA aon-shreath no dà-shreath a cheangal tro eadar-obrachaidhean neo-cho-bhailteach agus bacadh a chur air dealachadh agus glanadh le bhith a’ lughdachadh an àireamh de thargaidean a ruigeas soitheach ath-bhualaidh PCR mu dheireadh.
San fharsaingeachd, tha luchd-bacadh PCR an làthair anns a’ mhòr-chuid de lionntan bodhaig agus ath-bheachdan a thathas a’ cleachdadh airson deuchainnean breithneachaidh clionaigeach (urea ann am fual, haemoglobin agus heparin san fhuil), stuthan cur-ris daithead (co-phàirtean organach, glycogen, geir, ianan Ca2+) agus co-phàirtean san àrainneachd (phenols, meatailtean troma).

Gheibhear luchd-bacadh PCR nas cumanta ann am bacteria agus ceallan eukaryotic, DNA neo-thargaid, macromholacilean ceangailteach DNA de mhaitrisean clò agus uidheam obair-lann leithid miotagan agus plastaig. Is e glanadh searbhagan niùclasach rè no às deidh às-tharraing an dòigh as fheàrr airson luchd-bacadh PCR a thoirt air falbh.
An-diugh, faodaidh diofar uidheamachd às-tharraing fèin-ghluasadach mòran phròtacalan làimhe a chur an àite, ach cha deach 100% faighinn air ais agus/no glanadh thargaidean a choileanadh a-riamh. Is dòcha gu bheil luchd-bacadh a dh’fhaodadh a bhith ann fhathast anns na h-aigéid niuclasach glan no is dòcha gu bheil iad air buaidh a thoirt mu thràth. Tha diofar ro-innleachdan ann gus buaidh luchd-bacadh a lughdachadh. Faodaidh taghadh a’ phoilimearais iomchaidh buaidh mhòr a thoirt air gnìomhachd luchd-bacadh. Is e dòighean dearbhte eile gus casg PCR a lughdachadh dùmhlachd polymerase a mheudachadh no stuthan cur-ris leithid BSA a chuir an sàs.
Faodar casg air ath-bheachdan PCR a nochdadh le bhith a’ cleachdadh smachd càileachd pròiseas a-staigh (IPC).
Feumar a bhith faiceallach gun tèid na h-ath-bheachdan agus na fuasglaidhean eile uile anns a’ phasgan às-tharraing, leithid ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol agus phenol, a thoirt air falbh bhon searbhag niùclasach isolated le ceum nighe mionaideach. A rèir an dùmhlachd, faodaidh iad PCR a ghnìomhachadh no a bhacadh.