Factaran eadar-theachd ann an ath-bheachdan PCR

Rè ath-bhualadh PCR, thathas gu tric a’ tighinn tarsainn air cuid de fheartan eadar-theachd.
Mar thoradh air cho cugallach ‘s a tha PCR, thathas den bheachd gur e truailleadh aon de na factaran as cudromaiche a bheir buaidh air toraidhean PCR agus gun toir e toraidhean dearbhach meallta.
A cheart cho cudromach tha na diofar stòran a tha a’ leantainn gu toraidhean meallta-àicheil. Ma tha aon no barrachd phàirtean riatanach den mheasgachadh PCR no an ath-bhualadh leudachaidh fhèin air a bhacadh no air a chuir an sàs, faodar bacadh a chuir air a’ mheasadh breithneachail. Faodaidh seo leantainn gu èifeachdas nas lugha agus eadhon toraidhean àicheil meallta.
A bharrachd air casg, faodaidh call ionracas searbhag niuclasach targaid tachairt mar thoradh air suidheachaidhean luingeis agus / no stòraidh mus tèid sampall ullachadh. Gu sònraichte, faodaidh teòthachd àrd no stòradh gu leòr leantainn gu milleadh air ceallan agus searbhagan niuclasach. Tha suidheachadh cill is maothran agus freumhachadh paraffin nan adhbharan aithnichte airson briseadh DNA agus duilgheadas leantainneach (faic Figearan 1 agus 2). Anns na cùisean sin, cha chuidich eadhon an aonaranachd agus an glanadh as fheàrr.

Figear 1 | Buaidh neo-ghluasadachd air ionracas DNA
Sheall electrophoresis gel Agarose gu robh càileachd an DNA a chaidh a sgaradh bho earrannan paraffin de autopsies ag atharrachadh gu mòr. Bha DNA de dhiofar fhaid criomagan cuibheasach an làthair anns na h-earrannan a rèir an dòigh socrachaidh. Cha deach DNA a ghleidheadh ​​​​ach nuair a chaidh a shuidheachadh ann an sampallan reòta dùthchasach agus ann am formalin neodrach bufair. Mar thoradh air a bhith a’ cleachdadh stèidheadair Bouin a bha gu math searbhagach no formalin anns a bheil searbhag foirmeil, chaidh call mòr de DNA a dhèanamh. Tha am bloigh a tha air fhàgail gu math sgapte.
Air an taobh chlì, tha fad nam pìosan air a chuir an cèill ann an càraidean kilobase (kbp)

Figear 2 | Caill ionracas targaidean searbhag nucleic
(a) Bidh beàrn 3′-5′ air an dà shreath a’ leantainn gu briseadh san DNA targaid. bidh synthesis de DNA fhathast a’ tachairt air a’ chriomag bheag. Ach, ma tha làrach analachaidh primer a dhìth air a’ chriomag DNA, cha tachair ach leudachadh sreathach. Anns a ‘chùis as fàbharaiche, faodaidh na criomagan ath-shuidheachadh a chèile, ach bidh an toradh beag agus nas ìsle na ìrean lorgaidh.
(b) Tha call bhunaitean, gu h-àraidh mar thoradh air depurination agus cruthachadh thymidine dimer, a’ leantainn gu lùghdachadh anns an àireamh de bannan H agus lùghdachadh ann an Tm. Rè na h-ìre blàthachaidh fada, leagh na primers air falbh bhon DNA matrix agus cha chuir iad às eadhon fo chumhachan nach eil cho teann.
(c) Bidh bunaitean thymine ri thaobh a’ cruthachadh dimer TT.
Is e duilgheadas cumanta eile a tha gu tric a’ nochdadh ann an diagnosachd moileciuil an sgaoileadh nas lugha na an ìre as fheàrr de dh’ aigéid niuclasach targaid an coimeas ri toirt a-mach phenol-cloroform. Ann an cùisean fìor, faodaidh seo a bhith co-cheangailte ri àicheil àicheil. Faodar mòran ùine a shàbhaladh le bhith a’ goil lysis no le bhith a’ cnàmhadh sprùilleach cealla, ach gu tric bidh an dòigh seo a’ leantainn gu cugallachd PCR ìosal mar thoradh air nach eil gu leòr searbhag niuclasach air a leigeil ma sgaoil.

A 'bacadh gnìomhachd polymerase rè leudachadh

San fharsaingeachd, thathas a’ cleachdadh casg mar bhun-bheachd container gus cunntas a thoirt air a h-uile feart a tha a’ leantainn gu toraidhean PCR suboptimal. Ann an seagh gu tur bith-cheimiceach, tha casg air a chuingealachadh ri gnìomhachd an einnsein, ie, bidh e a’ lughdachadh no a’ casg tionndadh toraidh substrate tro eadar-obrachadh le làrach gnìomhach an DNA polymerase no an cofactor aige (me, Mg2 + airson Taq DNA polymerase).
Faodaidh co-phàirtean san t-sampall no diofar bufairean agus earrannan anns a bheil ath-bheachdan bacadh dìreach a chuir air an enzyme no grèim fhaighinn air na cofactors aige (me EDTA), mar sin a’ cur an gnìomh polymerase agus an uair sin a’ leantainn gu toraidhean PCR àicheil lùghdaichte no meallta.
Ach, tha mòran eadar-obrachaidhean eadar co-phàirtean ath-bhualadh agus searbhagan niuclasach le targaid cuideachd air an comharrachadh mar ‘luchd-bacadh PCR’. Cho luath ‘s a thèid ionracas na cealla a bhriseadh le aonaranachd agus an searbhag niuclasach air a leigeil ma sgaoil, faodaidh eadar-obrachadh eadar an sampall agus am fuasgladh timcheall air agus an ìre chruaidh tachairt. Mar eisimpleir, faodaidh ‘scavengers’ DNA singilte no dà-shreath a cheangal tro eadar-obrachaidhean neo-chovalent agus casg a chuir air aonaranachd agus glanadh le bhith a’ lughdachadh na h-àireamh de thargaidean a ruigeas soitheach freagairt PCR mu dheireadh.
San fharsaingeachd, tha luchd-bacadh PCR an làthair anns a’ mhòr-chuid de lionntan bodhaig agus ath-bheachdan air an cleachdadh airson deuchainnean breithneachaidh clionaigeach (urea ann am fual, hemoglobin agus heparin ann am fuil), stuthan daithead (co-phàirtean organach, glycogen, geir, ions Ca2 +) agus co-phàirtean san àrainneachd (phenols). , meatailtean trom)

Gheibhear luchd-bacadh PCR nas cumanta ann am bacteria agus ceallan eukaryotic, DNA neo-targaid, macromolecules ceangailteach DNA de mhatrices clò agus uidheamachd obair-lann leithid miotagan agus plastaic. Is e glanadh searbhagan niuclasach rè no às deidh às-tharraing an dòigh as fheàrr airson luchd-bacadh PCR a thoirt air falbh.
An-diugh, faodaidh grunn uidheamachd às-tharraing fèin-ghluasadach a dhol an àite mòran phròtacalan làimhe, ach cha deach faighinn seachad air 100% agus / no glanadh thargaidean a-riamh. Faodaidh luchd-bacadh a bhith fhathast an làthair anns na h-aigéid niuclasach fìor-ghlan no dh’ fhaodadh iad a bhith air a thighinn gu buil mu thràth. Tha diofar ro-innleachdan ann gus buaidh luchd-bacadh a lughdachadh. Faodaidh an taghadh de polymerase iomchaidh buaidh mhòr a thoirt air gnìomhachd luchd-dìon. Tha dòighean dearbhaidh eile airson casg PCR a lughdachadh a’ meudachadh dùmhlachd polymerase no a’ cleachdadh stuthan cur-ris leithid BSA.
Faodar casg air ath-bheachdan PCR a nochdadh le bhith a’ cleachdadh smachd càileachd pròiseas a-staigh (IPC).
Feumar a bhith faiceallach gun cuir thu air falbh a h-uile ath-bheachdan agus fuasglaidhean eile anns a’ ghoireas às-tharraing, leithid ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol agus phenol, bhon searbhag niuclasach aonaranach le ceum nighe mionaideach. A rèir an dùmhlachd, faodaidh iad PCR a chuir an gnìomh no casg a chuir air.